嵌合抗原受体（CAR）T细胞、双特异性T细胞等免疫细胞治疗的研究愈发火热，在肿瘤治疗中展现出新希望，但同样面临着新的挑战：细胞因子释放综合征（Cytokine Release Syndrome，CRS）
CRS是一种免疫过度激活的现象，会导致细胞因子分泌过多，如果不加以控制，可能会导致多器官衰竭和死亡。一篇涉及84项研究中2592名患者的Meta分析显示，血液系统恶性肿瘤和实体瘤的所有级别CRS发生率分别为：81%、37%，≥3 CRS发生率分别为：29%、19%^[1]。
研究者深知在临床前实验初期，不仅要关注免疫治疗效果，同样要关注CRS发生率和严重程度，以采取措施预防和减缓CRS带来的毒副作用。
因此，选择一种合适的研究模型兼顾免疫疗法的疗效验证与CRS安全性评估，可以事半功倍。本文将分别从体外模型、体内-免疫缺陷模型、体内-人源化模型三个方向对比CRS评价模型的优缺点。


体外模型（特异性T细胞和肿瘤抗原共孵育）可以初步检测细胞因子释放。
OKT3是一种CD3单克隆抗体，用于促进T细胞增殖和分化。将OKT3或特异性合成的PSMA/CD3双抗与添加了IL-2的PBMC共孵育，分别得到增殖分化好的T细胞。将OKT3-T细胞或双特异性T细胞（anti-PSMA/anti-CD3 BsAbs）与LNCaP细胞共培养，验证双特异性T细胞在体外对肿瘤的杀伤作用^[2]。

• 从健康供体的血液中分离人PBMC，并分别与四种类型的BsAb或传统的小鼠抗CD3抗体（OKT3）共培养，14天后分化扩增出特异性的CD3⁺CD8⁺T细胞（图1）。
• 双特异性T细胞较OKT3-T细胞展示出更强的对LNCaP细胞的杀伤性（图2），释放更高量的细胞因子（IL-2、INF-γ和TNF-α）和细胞毒素（穿孔素和颗粒酶B）（图3）。

  这种体外模型实验周期短且成本低，但不能提供有关全身免疫环境（血管内皮细胞、组织固有的免疫细胞等）、无法验证脱靶效应（交叉反应、非预期靶点激活）、神经毒性、组织损伤和器官衰竭等，还有可能带来假阳性结果，故还需进行进一步的体内实验验证。
需要注意的是为避免不同供体来源的PBMC本身差异性引发体内外实验的不一致和不可重复性，选择稳定可靠的优质供体进行实验至关重要。
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无论是CAR-T细胞、双特异性T细胞或是其它免疫细胞只有在体内实现维持和扩增才能发挥作用。SCID Beige鼠：T、B细胞缺失，NK细胞有缺陷，腹腔注射Raji细胞，3周后静脉回输CAR-T细胞，检测细胞因子的释放水平。CAR-T细胞回输前，肿瘤切片染色显示有浸润性髓系细胞的表达，而注射CAR-T细胞后，鼠源髓系细胞表达显著上调，证明CAR-T细胞募集并激活鼠源髓系细胞，产生大量细胞因子引发CRS^[3]。

• 荷瘤小鼠回输CAR-T细胞后，体重明显下降（图4），整体细胞因子的表达水平与生存率及CRS的严重程度密切相关（图5）。
• IL-3和GM-CSF是人源CAR-T细胞产生，而其他细胞因子如IL-6是由内源性鼠源细胞产生（图6）。
• CAR-T细胞注射后主要集中在腹膜部位，脾脏或其他组织中没有发现（图7），腹膜部位的髓系细胞比例显著提升（图8）。

上述研究中用到的SCID Beige鼠为部分免疫缺陷，主要是依赖鼠源髓系细胞进行CRS评估，同时小鼠体内还缺乏人源细胞因子和人源免疫系统，T细胞注射后难以实现大量扩增和长期维持，因而无法准确进行CRS评价。
如，使用SCID小鼠评估双特异性T细胞的有效性及安全性实验^[2]，虽然双特异性T细胞组展示了很好的抗肿瘤效果（图10），但可能由于没有人源免疫细胞的参与，并没有引发大量细胞因子释放的毒副作用（图9）。 CRS的发生不仅仅是由肿瘤抗原与CAR-T细胞相互作用引发，更是多种免疫细胞相互作用的结果。因而，需要一种可以重建人源T细胞、髓系细胞等多种免疫细胞的模型，以精确地进行CRS评估。
并且如果体内T细胞的维持和增殖受限，将无法发挥药效，还需借助于超重度免疫缺陷鼠NOG及其衍生小鼠（NOG-dKO/NOG-EXL/hIL-2 NOG）的人源化模型进行实验。


这里我们介绍的免疫系统人源化小鼠主要是指huHSC-NOG-EXL：将huHSC-CD34⁺移植到NOG-EXL小鼠（转入编码人IL-3和GM-CSF基因的NOG小鼠），可以重建多种免疫细胞，包括：T细胞、B细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，更能模拟人的免疫细胞组成，呈现更完整的人类免疫系统（图12）^[4]。   采用常规免疫缺陷小鼠荷瘤模型通常情况下观察到的细胞因子释放是有限的 , 不能有效地评估CAR-T 细胞治疗的安全性。研究结果表明^[5]，当在临床前实验研究或预测 CAR-T 细胞产品的细胞因子释放强度时，相比于常规的荷瘤小鼠，免疫重建的NOG-EXL小鼠是更适合的模型。研究者使用huHSC-NOG-EXL小鼠，给予肿瘤负荷并输注CAR-T细胞后，可见明显的各类细胞因子的释放（图13），其中 IL-6 的最高释放个体达到6000 pg/mL 水平。但细胞因子释放的时机同临床相比较早，持续的时间也较短。   CAR-T细胞激活后，会释放出高水平的IFNγ，诱导激活其他免疫细胞亚群（主要是巨噬细胞），随之产生更多的细胞因子，加重炎症反应，提高CAR-T细胞抗肿瘤活性的同时，也引发不良反应^[6]。本研究^[7]证明，Emapalumab(一种针对IFNγ的单克隆抗体)能够显著减弱CAR-T细胞治疗引发的CRS，而不会损害CAR-T细胞的抗肿瘤活性。

• NSG小鼠模型中，Emapalumab单抗治疗不影响CAR-T细胞的抗肿瘤活性(图14)。
• huHSC-NOG-EXL小鼠移植经照射的CD19⁺Daudi（irrDaudi）FF-LUC细胞系后静脉注射CAR-T细胞，进行Emapalumab单抗治疗，治疗后IFNγ和 IL-6释放显著降低(图15)，但不影响CAR.CD19-T细胞的扩增(图16)。
• huHSC-NOG-EXL小鼠注射CAR-T细胞后7天内出现死亡，Emapalumab单抗治疗的组别小鼠生存情况明显改善，生存观察期延长至15天(图17)。

  回输CAR-T细胞，huHSC-NOG-EXL小鼠细胞因子释放水平显著提高。通过Emapalumab单抗治疗，细胞因子释放得到控制，小鼠生存期明显改善，表明CRS得到控制，充分证明huHSC-NOG-EXL小鼠是CRS评价的优选模型。 CRS（细胞因子释放综合征）通常发生在免疫细胞输注后的几天内，伴随体内免疫细胞的活化与扩增^[8,9]。释放出大量细胞因子和炎症因子（如IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等），是免疫细胞治疗安全性评价中的重要指标。在临床前探究中，

• 体外CRS模型：可用于临床前安评的初级评估，由于无法反映T细胞及其产生的细胞因子对其它免疫细胞的影响以及相互作用，还需要结合体内模型。
• 体内CRS模型：免疫缺陷小鼠可部分模拟细胞药物与肿瘤在体内的相互作用。然而因缺乏人免疫系统和细胞因子的表达，T细胞的增殖分化受限，并且会受到鼠源免疫细胞的影响。免疫系统人源化模型huHSC-NOG-EXL鼠源免疫功能超重度缺陷，并可重建多种人免疫细胞（T细胞、髓系细胞等），进一步模拟人的免疫系统，在临床前为细胞疗法引发的CRS提供适宜的研究环境。

参考文献

1. Lei W, Xie M, Jiang Q, Xu N, Li P, Liang A, et al. Treatment-related adverse events of chimeric antigen receptor T-cell (CAR T) in clinical trials: a systematic review and meta-analysis. Cancers (Basel) (2021) 13(15):1–25. doi: 10.3390/cancers13153912
2. Yi‑Jou C, Michael C, Tian‑Lu C, et al. A non-genetic engineering platform for rapidly generating and expanding cancer-specifc armed T cells. Journal of Biomedical Science (2023) 30:35. doi.org/10.1186/s12929-023-00929-z
3. Giavridis T, van der Stegen SJC, Eyquem J, Hamieh M, Piersigilli A, Sadelain M. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by IL-1 blockade. Nat Med (2018) 24(6):731–8. doi: 10.1038/s41591-018-0041-7
4. Maser, Ilona Petra , et al. The Tumor Milieu Promotes Functional Human Tumor-Resident Plasmacytoid Dendritic Cells in Humanized Mouse Models. Frontiers in Immunology 11(2020):2082. doi: 10.3389/fimmu.2020.02082
5. JOINN Biologics. “适用于CAR-T细胞治疗产品CRS评价的动物模型”昭衍JOINN. 28, Apr. 2020.
6. Matthys, P. et al. Modification of the anti-CD3-induced cytokine release syndrome by anti-interferon-gamma or anti-interleukin-6 antibody treatment: protective effects and biphasic changes in blood cytokine levels. Eur. J. Immunol. 23, 2209–2216 (1993).
7. Simona Manni, Francesca Del Bufalo, et al. Neutralizing IFNγ improves safety without compromising efficacy of CAR-T cell therapy in B-cell malignancies. Nat Commun. 2023; 14: 3423. doi: 10.1038/s41467-023-38723-y
8. Wei J, Liu Y, Wang C, Zhang Y, Tong C, Dai G, et al. The model of cytokine release syndrome in CAR T-cell treatment for B-cell non-Hodgkin lymphoma. Signal Transduct Target Ther (2020) 5(1):134. doi: 10.1038/s41392-020-00256-x
9. Morris EC, Neelapu SS, Giavridis T, Sadelain M. Cytokine release syndrome and associated neurotoxicity in cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol (2022) 22(2):85–96. doi: 10.1038/s41577-021-00547-6